Появата на методи за манипулиране на генетичен материал
бележи реална революция в биологията, биотехнологията и медицината. Насочената
интервенция в генома на живите организми позволи на човека да реши широк
спектър от задачи, вариращи от създаване на модифицирани видове бактерии,
растения и животни с нови ценни свойства и клетъчни модели, необходими за
създаване на нови лекарства, за разработване на методи за генна терапия,
отваряне на перспективи за коригиране на вродени генетични нарушения
Но за да успеят успешно да нахлуят в "светая светих" клетки - неговия наследствен материал, са необходими технологии, които позволяват разделяне и комбиниране на ДНК молекули в дадени региони. Наистина революционен пробив в тази област настъпи само преди няколко години, когато на базата на механизмите на "бактериален имунитет" беше разработен прост метод на генно инженерство CRISPR / Cas, който осигурява точен ефект върху дадени участъци от ДНК. Този метод отвори фундаментално нови възможности за манипулация на геномното ниво на висши организми, което ви позволява да въведете точкови мутации, за корекция, вграждане или изтриване на фрагменти и дори цели гени.
За успешно нахлуване в " светая светих " на клетката - нейния наследствен материал, са необходими технологии, които позволяват разделяне и комбиниране на ДНК молекули в дадени региони.
За тези цели може да се използват рестриктази - ензими, които могат да разпознаят специфични къси нуклеотидни последователности и да разрушат ДНК молекулата. За свързване на нуклеотидни фрагменти се използват ДНК лигазни ензими, които са част от естествените ензимни комплекси, които възстановяват увреждането на ДНК структурата. ДНК омрежването може да се осъществи и чрез ензимни комплекси на рекомбинационната система, поради което хомоложните фрагменти се обменят в състава на геномната ДНК по време на образуването на зародишни клетки.
Откриването на рестрикционни ензими и ДНК лигаз през 1960-1970. е тласък за появата на генното инженерство: с помощта на тези ензими е възможно да се разцепи ДНК в дадени фрагменти и да ги свърже отново, образувайки нови генетични конструкции. По този начин се получават различните варианти на бактериалните и вирусните геноми.
Но за да успеят успешно да нахлуят в "светая светих" клетки - неговия наследствен материал, са необходими технологии, които позволяват разделяне и комбиниране на ДНК молекули в дадени региони. Наистина революционен пробив в тази област настъпи само преди няколко години, когато на базата на механизмите на "бактериален имунитет" беше разработен прост метод на генно инженерство CRISPR / Cas, който осигурява точен ефект върху дадени участъци от ДНК. Този метод отвори фундаментално нови възможности за манипулация на геномното ниво на висши организми, което ви позволява да въведете точкови мутации, за корекция, вграждане или изтриване на фрагменти и дори цели гени.
За успешно нахлуване в " светая светих " на клетката - нейния наследствен материал, са необходими технологии, които позволяват разделяне и комбиниране на ДНК молекули в дадени региони.
За тези цели може да се използват рестриктази - ензими, които могат да разпознаят специфични къси нуклеотидни последователности и да разрушат ДНК молекулата. За свързване на нуклеотидни фрагменти се използват ДНК лигазни ензими, които са част от естествените ензимни комплекси, които възстановяват увреждането на ДНК структурата. ДНК омрежването може да се осъществи и чрез ензимни комплекси на рекомбинационната система, поради което хомоложните фрагменти се обменят в състава на геномната ДНК по време на образуването на зародишни клетки.
Откриването на рестрикционни ензими и ДНК лигаз през 1960-1970. е тласък за появата на генното инженерство: с помощта на тези ензими е възможно да се разцепи ДНК в дадени фрагменти и да ги свърже отново, образувайки нови генетични конструкции. По този начин се получават различните варианти на бактериалните и вирусните геноми.
Настояще
и бъдеще
Поради своята простота, ефективност и широки възможности, системата CRISPR / Cas за кратко време вече е намерила приложение в различни области на фундаменталната и приложната биология, биотехнологията и медицината.
Като правят модификации на различните елементи на генома на животинските и растителните клетки и изучават ефектите, учените имат възможност да изследват ролята на отделните гени във функционирането на отделните клетки и организма като цяло. Редица мутантни лабораторни животни (мишки, плъхове, жаби, риби) вече са получени при използване на CRISPR / Cas система. Всички тези моделни организми отварят нови перспективи за изследвания в областта на биологията на развитието, имунологията и изучаването на болести при хора и животни.
Уникалната способност на CRISPR / Cas комплекса да се свързва селективно към специфични ДНК области, направи възможно да се развият регулатори на генната активност на нейната база. За да се постигне това, системата включва каталитично неактивен мутант протеин Cas9, към който могат да бъдат прикрепени протеини, които активират или потискат функциите на промотори, които контролират работата на гените. Когато такъв комплекс е свързан с таргетната ДНК, работата на целевия ген може да бъде потисната или стимулирана.
Освен това, използвайки CRISPR / Cas системата, е възможно едновременно да се въведат в клетките няколко генетични конструкции, насочени към различни области на генома. Това ви позволява да влияете върху работата на няколко гена едновременно, за да изследвате връзката между тях и тяхното участие в нормалните и патологични процеси на жизнената активност. По този начин е възможно, например, да се идентифицират мутации в гените, отговорни за развитието на резистентност на рака към химиотерапия.
Една от най-важните задачи на съвременната биомедицина е създаването на клетъчни модели за търсене и предклинично изследване на нови лекарства. Чрез въвеждане на насочени модификации в генома на човешките стволови клетки се получават модели на клетъчни линии на наследствени заболявания, причинени от нарушени функции на определени гени. Такива клетъчни линии всъщност са неограничен източник на "пациенти in vitro", върху които могат да бъдат тествани десетки хиляди различни химични съединения - потенциални лекарства.
Високите надежди за CRISPR / Cas също са поставени във връзка с развитието на генната терапия. Въпреки дългогодишните обширни изследвания, към днешна дата не е било възможно да се разработят приемливи методи за въвеждане в клетките на гени, които заменят дефектни. Основната причина за неуспеха е използването на генетични конструкции, съдържащи „екстра” ДНК (бактериална или вирусна), още повече, те са внедрени неконтролируемо в произволни области на генома. Всичко това доведе до различни нарушения на генетичния апарат, включително дегенерация на злокачествени клетки. Въпреки това, CRISPR / Cas позволява гените да бъдат въведени в генома с хирургическа точност, което прави генната терапия безопасна.
Нещо повече, с помощта на този метод е възможно да не се въвеждат „външни лица“ отвън, а да се редактира собственият ни генетичен апарат, като същевременно се запазват „нашите собствени“ регулаторни системи. Така успяхме да редактираме аномалния ген в стволовите клетки на пациент, страдащ от кистозна фиброза. Такива клетки с "ремонтиран" геном могат да бъдат трансплантирани обратно в тялото на пациента, където те ще заменят болните клетки и ще възстановят загубената си функция.
Поради своята простота, ефективност и широки възможности, системата CRISPR / Cas за кратко време вече е намерила приложение в различни области на фундаменталната и приложната биология, биотехнологията и медицината.
Като правят модификации на различните елементи на генома на животинските и растителните клетки и изучават ефектите, учените имат възможност да изследват ролята на отделните гени във функционирането на отделните клетки и организма като цяло. Редица мутантни лабораторни животни (мишки, плъхове, жаби, риби) вече са получени при използване на CRISPR / Cas система. Всички тези моделни организми отварят нови перспективи за изследвания в областта на биологията на развитието, имунологията и изучаването на болести при хора и животни.
Уникалната способност на CRISPR / Cas комплекса да се свързва селективно към специфични ДНК области, направи възможно да се развият регулатори на генната активност на нейната база. За да се постигне това, системата включва каталитично неактивен мутант протеин Cas9, към който могат да бъдат прикрепени протеини, които активират или потискат функциите на промотори, които контролират работата на гените. Когато такъв комплекс е свързан с таргетната ДНК, работата на целевия ген може да бъде потисната или стимулирана.
Освен това, използвайки CRISPR / Cas системата, е възможно едновременно да се въведат в клетките няколко генетични конструкции, насочени към различни области на генома. Това ви позволява да влияете върху работата на няколко гена едновременно, за да изследвате връзката между тях и тяхното участие в нормалните и патологични процеси на жизнената активност. По този начин е възможно, например, да се идентифицират мутации в гените, отговорни за развитието на резистентност на рака към химиотерапия.
Една от най-важните задачи на съвременната биомедицина е създаването на клетъчни модели за търсене и предклинично изследване на нови лекарства. Чрез въвеждане на насочени модификации в генома на човешките стволови клетки се получават модели на клетъчни линии на наследствени заболявания, причинени от нарушени функции на определени гени. Такива клетъчни линии всъщност са неограничен източник на "пациенти in vitro", върху които могат да бъдат тествани десетки хиляди различни химични съединения - потенциални лекарства.
Високите надежди за CRISPR / Cas също са поставени във връзка с развитието на генната терапия. Въпреки дългогодишните обширни изследвания, към днешна дата не е било възможно да се разработят приемливи методи за въвеждане в клетките на гени, които заменят дефектни. Основната причина за неуспеха е използването на генетични конструкции, съдържащи „екстра” ДНК (бактериална или вирусна), още повече, те са внедрени неконтролируемо в произволни области на генома. Всичко това доведе до различни нарушения на генетичния апарат, включително дегенерация на злокачествени клетки. Въпреки това, CRISPR / Cas позволява гените да бъдат въведени в генома с хирургическа точност, което прави генната терапия безопасна.
Нещо повече, с помощта на този метод е възможно да не се въвеждат „външни лица“ отвън, а да се редактира собственият ни генетичен апарат, като същевременно се запазват „нашите собствени“ регулаторни системи. Така успяхме да редактираме аномалния ген в стволовите клетки на пациент, страдащ от кистозна фиброза. Такива клетки с "ремонтиран" геном могат да бъдат трансплантирани обратно в тялото на пациента, където те ще заменят болните клетки и ще възстановят загубената си функция.
Използването на метода CRISPR / Cas в комбинация с
клетъчните технологии разкрива принципно възможността за освобождаване на
хората от генетични заболявания като захарен диабет, хорея на Хънтингтън,
мускулни дистрофии и др. Генетичната интервенция може да се извърши на ниво
ембриони, получени по време на ин витро оплождане, Можете да развиете
организъм, всички клетки от който ще имат модифициран геном. Единствените
пречки пред развитието на такива технологии са етичните проблеми: цялото
необходимо оборудване вече съществува и е тествано върху лабораторни животни.
Например, възможно е да се отглеждат здрави мишки от ембрионални клетки, в
които е коригиран дефектен ген, отговорен за развитието на катаракта. Тези индивиди
дадоха здраво потомство.
Съвременните лекарства, за съжаление, не могат да повлияят на вирусната ДНК, която е в състава на човешката ДНК. Системите, работещи по механизма CRISPR, могат в бъдеще радикално да лекуват подобни хронични заболявания, причинени от вируси, които се интегрират в човешкия геном (вируси на хепатит В, херпес вируси, ХИВ и др.). Така съществува известен случай на излекуване на така наречения „Берлински пациент” Т. Браун от СПИН в резултат на трансплантация на кръвни стволови клетки от донор, който носи мутация „имунитет” към ХИВ. С помощта на CRISPR / Cas технологията е възможно да се въведе мутация в този ген в клетките, които след това могат да бъдат трансплантирани в заразения организъм.
Една от най-важните задачи на съвременната биотехнология е създаването на нови породи добитък, както и на земеделски култури, високопродуктивни и устойчиви на неблагоприятни условия. Основната цел на прилагането на метода CRISPR / Cas в биотехнологията е създаването на генетично модифицирани животни и засадени растения, които биха имали нови ценни свойства. Използвайки тази система, вече са направени точни модификации в генома на пшеницата и тютюна, получени са сортове ориз, устойчиви на Xanthomonas бактерии, причиняващи бактериална гниене, което причинява големи икономически щети на селското стопанство.
Друго интересно биотехнологично направление в използването на системата CRISPR / Cas е да се получат линии на животни или растения, които могат да синтезират човешки протеини, например, инсулин, необходим на диабетици, или албумин, използван за лечение на хеморагичен шок, изгаряния и цироза на черния дроб. Сега албуминът се получава от човешка кръвна плазма - много ограничен източник, но глобалната нужда от това лекарство непрекъснато расте и днес е 500 тона годишно. Използвайки геномни инженерни техники, генът на човешкия албумин вече е въведен в генома на ориза и говедата. Този протеин може да бъде изолиран от растителни и животински тъкани, където е синтезиран и след почистване се използва за медицински цели.
Без съмнение, в близко бъдеще системата CRISPR / Cas ще бъде подобрена: можем да очакваме опростяване на каталитичния компонент на протеина, повишаване на селективността на системата, по-ефективно средство за доставяне на различни видове клетки и цели организми. Вече са получени данни, които сочат, че въз основа на системата CRISPR е възможно да се създадат средства за насочване не само на ДНК, но и на РНК, което ще отвори нови възможности за регулиране на генната активност и борба с вирусни инфекции.
Въпреки че системата за редактиране на геноми на CRISPR / Cas е създадена едва през 2012 г., тя вече се използва в много лаборатории и компании в развитите страни. Публикувани стотици резултати от научни изследвания, използващи тази технология, описани десетки успешни експерименти за редактиране на геноми на дрожди, гризачи, насекоми, растения и човешки клетки.
Компонентите на системата под формата на готови комплекти са произведени от Life Technologies, която наскоро се сля с Thermo Fisher (САЩ) и са достъпни за изследователите. Най-големите фармацевтични компании, като Takeda, образуват банки CRISPR на генетично модифицирани стволови клетки - клетъчни модели на заболявания.
Въпреки активното използване на тази технология в големи световни изследователски центрове, в Русия CRISPR / Cas се използва само в няколко научноизследователски центъра, включително в Академгородок в Новосибирск. Днес, TALENs и CRISPR / Cas технологиите се използват в епигенетичната лаборатория за развитие на Института по цитология и генетика на Сибирския клон на Руската академия на науките, Лабораторията по молекулярна и клетъчна медицина на Института по патология на кръвообращението. Академик Е. Н. Мешалкин и в лабораторията на стволовите клетки на Института по химична биология и фундаментална медицина на Сибирския филиал на Руската академия на науките в дейности, свързани с въвеждане на мутации в човешки стволови клетки, по-специално за създаване на клетъчни модели на амиотрофична латерална склероза, болест на Алцхаймер, Паркинсонов синдром и удължен интервал QT.
Въпреки това, за провеждане на пълномащабни изследвания с помощта на TALENs и CRISPR / Cas, е необходимо да се създаде консорциум за клетъчни технологии с участието на водещи експерти на базата на съответните изследователски институти на Руската академия на медицинските науки: кардиология, имунология, неврология, онкология и др. за разработване на нови биомедицински технологии и високотехнологична фармацевтична промишленост - приоритетни области за развитие на научно-техническия потенциал страна.
В момента се разработва проектът за човешки клетъчни болести в Биобанк, който ще се основава на линии на индуцирани плурипотентни стволови клетки, получени от обикновени соматични клетки на хора, страдащи от различни наследствени и придобити заболявания. В допълнение, Biobank ще включва клетъчни модели на наследствени заболявания при хора - клетъчни линии, получени при използване на геномни инженерни методи TALENs и CRISPR / Cas.
Съвременните лекарства, за съжаление, не могат да повлияят на вирусната ДНК, която е в състава на човешката ДНК. Системите, работещи по механизма CRISPR, могат в бъдеще радикално да лекуват подобни хронични заболявания, причинени от вируси, които се интегрират в човешкия геном (вируси на хепатит В, херпес вируси, ХИВ и др.). Така съществува известен случай на излекуване на така наречения „Берлински пациент” Т. Браун от СПИН в резултат на трансплантация на кръвни стволови клетки от донор, който носи мутация „имунитет” към ХИВ. С помощта на CRISPR / Cas технологията е възможно да се въведе мутация в този ген в клетките, които след това могат да бъдат трансплантирани в заразения организъм.
Една от най-важните задачи на съвременната биотехнология е създаването на нови породи добитък, както и на земеделски култури, високопродуктивни и устойчиви на неблагоприятни условия. Основната цел на прилагането на метода CRISPR / Cas в биотехнологията е създаването на генетично модифицирани животни и засадени растения, които биха имали нови ценни свойства. Използвайки тази система, вече са направени точни модификации в генома на пшеницата и тютюна, получени са сортове ориз, устойчиви на Xanthomonas бактерии, причиняващи бактериална гниене, което причинява големи икономически щети на селското стопанство.
Друго интересно биотехнологично направление в използването на системата CRISPR / Cas е да се получат линии на животни или растения, които могат да синтезират човешки протеини, например, инсулин, необходим на диабетици, или албумин, използван за лечение на хеморагичен шок, изгаряния и цироза на черния дроб. Сега албуминът се получава от човешка кръвна плазма - много ограничен източник, но глобалната нужда от това лекарство непрекъснато расте и днес е 500 тона годишно. Използвайки геномни инженерни техники, генът на човешкия албумин вече е въведен в генома на ориза и говедата. Този протеин може да бъде изолиран от растителни и животински тъкани, където е синтезиран и след почистване се използва за медицински цели.
Без съмнение, в близко бъдеще системата CRISPR / Cas ще бъде подобрена: можем да очакваме опростяване на каталитичния компонент на протеина, повишаване на селективността на системата, по-ефективно средство за доставяне на различни видове клетки и цели организми. Вече са получени данни, които сочат, че въз основа на системата CRISPR е възможно да се създадат средства за насочване не само на ДНК, но и на РНК, което ще отвори нови възможности за регулиране на генната активност и борба с вирусни инфекции.
Въпреки че системата за редактиране на геноми на CRISPR / Cas е създадена едва през 2012 г., тя вече се използва в много лаборатории и компании в развитите страни. Публикувани стотици резултати от научни изследвания, използващи тази технология, описани десетки успешни експерименти за редактиране на геноми на дрожди, гризачи, насекоми, растения и човешки клетки.
Компонентите на системата под формата на готови комплекти са произведени от Life Technologies, която наскоро се сля с Thermo Fisher (САЩ) и са достъпни за изследователите. Най-големите фармацевтични компании, като Takeda, образуват банки CRISPR на генетично модифицирани стволови клетки - клетъчни модели на заболявания.
Въпреки активното използване на тази технология в големи световни изследователски центрове, в Русия CRISPR / Cas се използва само в няколко научноизследователски центъра, включително в Академгородок в Новосибирск. Днес, TALENs и CRISPR / Cas технологиите се използват в епигенетичната лаборатория за развитие на Института по цитология и генетика на Сибирския клон на Руската академия на науките, Лабораторията по молекулярна и клетъчна медицина на Института по патология на кръвообращението. Академик Е. Н. Мешалкин и в лабораторията на стволовите клетки на Института по химична биология и фундаментална медицина на Сибирския филиал на Руската академия на науките в дейности, свързани с въвеждане на мутации в човешки стволови клетки, по-специално за създаване на клетъчни модели на амиотрофична латерална склероза, болест на Алцхаймер, Паркинсонов синдром и удължен интервал QT.
Въпреки това, за провеждане на пълномащабни изследвания с помощта на TALENs и CRISPR / Cas, е необходимо да се създаде консорциум за клетъчни технологии с участието на водещи експерти на базата на съответните изследователски институти на Руската академия на медицинските науки: кардиология, имунология, неврология, онкология и др. за разработване на нови биомедицински технологии и високотехнологична фармацевтична промишленост - приоритетни области за развитие на научно-техническия потенциал страна.
В момента се разработва проектът за човешки клетъчни болести в Биобанк, който ще се основава на линии на индуцирани плурипотентни стволови клетки, получени от обикновени соматични клетки на хора, страдащи от различни наследствени и придобити заболявания. В допълнение, Biobank ще включва клетъчни модели на наследствени заболявания при хора - клетъчни линии, получени при използване на геномни инженерни методи TALENs и CRISPR / Cas.
Вируси
и бактерии – вечната война
Бактериофагите са вируси, които заразяват само бактерии. По време на инфекцията, те засягат всички жизнени процеси на бактериалната клетка, превръщайки я в завод за производство на вирусно потомство. В крайна сметка клетката се разрушава и новообразуваните вирусни частици излизат навън и могат да заразят нови бактерии.
Въпреки огромния брой и разнообразие на естествените фаги, рядко се срещаме с тях. Въпреки това, има ситуации, в които активността на тези вируси не остава незабелязана. Например в заводите, които произвеждат сирена, кисели млека и други млечнокисели продукти, често се среща вирусна атака срещу бактерии, които ферментират мляко. В повечето от тези случаи фаговата инфекция се разпространява със светкавична скорост и полезните бактерии умират, което води до значителни икономически загуби.
Именно благодарение на приложните изследвания в интерес на млечната промишленост, насочени към получаване на щамове от бактериофаги, устойчиви на бактериофаги, бяха открити редица механизми, чрез които бактериите избягват инфекция. Успоредно с това са изследвани начините, по които вирусите, от своя страна, преодоляват бактериални защитни системи.
Който
е защитен - това е въоръжен
Към днешна дата има пет основни, много умни защитни механизми, които бактериите са се развили в тяхната непрекъсната борба срещу вирусите: промяна в рецептора на клетъчната повърхност; елиминиране на суперинфекцията; системи за неуспешна инфекция; системи за рестрикционна модификация и, накрая, CRISPR-Cas системи.
Към днешна дата има пет основни, много умни защитни механизми, които бактериите са се развили в тяхната непрекъсната борба срещу вирусите: промяна в рецептора на клетъчната повърхност; елиминиране на суперинфекцията; системи за неуспешна инфекция; системи за рестрикционна модификация и, накрая, CRISPR-Cas системи.
Вирусната атака започва с прикрепването на фага към
специфичен рецептор на повърхността на бактериалната клетка, но при загуба на
рецептора или промяна в неговата структура, вирусът не се свързва. Бактериите
могат да променят рецепторите в зависимост от условията на околната среда, като
плътност и разнообразие на микроорганизми в околната среда, както и наличието
на хранителни вещества. Любопитен пример са бактериите от вида Vibrio
anguillarum, които са способни да образуват биофилм, т.е. гъст слой от клетки,
прикрепен към повърхността. Тази бактерия има своеобразно „чувство на кворум”,
поради което, с увеличаване на плътността на клетките, тяхното производство на
рецептора намалява, с което вирусът може да се свърже. В резултат на това
биофилмът става почти напълно устойчив на инфекции.
Обаче, загубата на рецептори не винаги е полезна за бактерии, тъй като те изпълняват различни важни функции, например, транспортиране на хранителни вещества или образуване на клетъчно-клетъчни контакти. В резултат на това, за всяка двойка „бактериофагов бактериофаг” в хода на еволюцията се открива оптимално решение, което осигурява приемливо ниво на защита при запазване на възможността за бактериален растеж при различни условия на околната среда.
Следващият защитен механизъм е изключването на суперинфекцията. За бактериофагите са известни два основни пътя на инфекцията: литичен, водещ до бърза смърт на заразени бактерии с освобождаване на вирусно потомство, и продължителен лизогенен път, когато наследственият материал на вируса е вътре в бактериалния геном, удвоява се само с ДНК-гостоприемника, без да навреди на клетката. Когато една клетка е в състояние на лизогенна инфекция, тогава, от гледна точка на "домашния" вирус (профаг), неговата инфекция с друг вирус е нежелана.
В действителност много вируси, които са вмъкнали своята ДНК в генома на клетката, ограничават повторното влизане на бактериофага в клетката ("суперинфекция") чрез специални репресорни протеини, които не позволяват на новите гени да работят (Calendar, 2006). Някои фаги предотвратяват навлизането на други вирусни частици в заразените клетки, като действат върху неговите рецептори. В резултат на това бактериите, които носят вируса, имат очевидно предимство пред неинфектираните.
Обаче, загубата на рецептори не винаги е полезна за бактерии, тъй като те изпълняват различни важни функции, например, транспортиране на хранителни вещества или образуване на клетъчно-клетъчни контакти. В резултат на това, за всяка двойка „бактериофагов бактериофаг” в хода на еволюцията се открива оптимално решение, което осигурява приемливо ниво на защита при запазване на възможността за бактериален растеж при различни условия на околната среда.
Следващият защитен механизъм е изключването на суперинфекцията. За бактериофагите са известни два основни пътя на инфекцията: литичен, водещ до бърза смърт на заразени бактерии с освобождаване на вирусно потомство, и продължителен лизогенен път, когато наследственият материал на вируса е вътре в бактериалния геном, удвоява се само с ДНК-гостоприемника, без да навреди на клетката. Когато една клетка е в състояние на лизогенна инфекция, тогава, от гледна точка на "домашния" вирус (профаг), неговата инфекция с друг вирус е нежелана.
В действителност много вируси, които са вмъкнали своята ДНК в генома на клетката, ограничават повторното влизане на бактериофага в клетката ("суперинфекция") чрез специални репресорни протеини, които не позволяват на новите гени да работят (Calendar, 2006). Някои фаги предотвратяват навлизането на други вирусни частици в заразените клетки, като действат върху неговите рецептори. В резултат на това бактериите, които носят вируса, имат очевидно предимство пред неинфектираните.
По време на инфекцията всички ресурси на бактериалната
клетка са насочени към производството на нови вирусни частици. Ако до такава
клетка има и други уязвими бактерии, инфекцията бързо ще се разпространи и ще
причини смъртта на повечето от тях. Въпреки това, за такива случаи, бактериите
имат така наречените абортни инфекциозни системи, които водят до неговата
програмирана смърт. Разбира се, този "алтруистичен" механизъм няма да
спаси заразената клетка, но ще спре разпространението на вирусна инфекция,
която е полезна за цялото население. Бактериалните системи на абортна инфекция
са много разнообразни, но подробностите за тяхното функциониране не са проучени
достатъчно.
Средствата за антивирусна защита на бактериите включват системи за рестрикционна модификация, които включват гени, кодиращи два протеин-ензима, рестрикционен ензим и метилаза. Рестрикционният ензим разпознава определени ДНК последователности с дължина от 4-6 нуклеотида и въвежда двуверижни разкъсвания в тях. Метилазата, напротив, ковалентно модифицира тези последователности чрез добавяне на метилови групи към отделни нуклеотидни бази, което предотвратява тяхното разпознаване чрез рестрикционен ензим.
В ДНК на бактериите, съдържащи такава система, всички сайтове са модифицирани. И ако бактерията е заразена с вирус, чиято ДНК не съдържа такава модификация, рестрикционният ензим ще предпазва от инфекция чрез унищожаване на вирусната ДНК. Много вируси "се борят" със системи за рестрикционна модификация, без да използват последователности, разпознавани от рестрикционния ензим в техните геноми - очевидно е, че вирусните варианти с различна стратегия просто не оставят никакво потомство.
Последната и понастоящем най-интересна система от бактериален имунитет е системата CRISPR-Cas, с помощта на която бактериите са в състояние да „напишат” на собствения си геном и да предадат на потомството информация за фагите, които са срещнали по време на живота си. Наличието на такива "спомени" ви позволява да разпознаете ДНК на фага и по-ефективно да се противопоставите на неговите повторни инфекции. Понастоящем се отделя голямо внимание на системите CRISPR-Cas, тъй като те са се превърнали в основа на революционна технология за редактиране на геноми, която в бъдеще може да даде възможност за лечение на генетични заболявания и създаване на нови породи и разновидности на селскостопански животни и растения.
Средствата за антивирусна защита на бактериите включват системи за рестрикционна модификация, които включват гени, кодиращи два протеин-ензима, рестрикционен ензим и метилаза. Рестрикционният ензим разпознава определени ДНК последователности с дължина от 4-6 нуклеотида и въвежда двуверижни разкъсвания в тях. Метилазата, напротив, ковалентно модифицира тези последователности чрез добавяне на метилови групи към отделни нуклеотидни бази, което предотвратява тяхното разпознаване чрез рестрикционен ензим.
В ДНК на бактериите, съдържащи такава система, всички сайтове са модифицирани. И ако бактерията е заразена с вирус, чиято ДНК не съдържа такава модификация, рестрикционният ензим ще предпазва от инфекция чрез унищожаване на вирусната ДНК. Много вируси "се борят" със системи за рестрикционна модификация, без да използват последователности, разпознавани от рестрикционния ензим в техните геноми - очевидно е, че вирусните варианти с различна стратегия просто не оставят никакво потомство.
Последната и понастоящем най-интересна система от бактериален имунитет е системата CRISPR-Cas, с помощта на която бактериите са в състояние да „напишат” на собствения си геном и да предадат на потомството информация за фагите, които са срещнали по време на живота си. Наличието на такива "спомени" ви позволява да разпознаете ДНК на фага и по-ефективно да се противопоставите на неговите повторни инфекции. Понастоящем се отделя голямо внимание на системите CRISPR-Cas, тъй като те са се превърнали в основа на революционна технология за редактиране на геноми, която в бъдеще може да даде възможност за лечение на генетични заболявания и създаване на нови породи и разновидности на селскостопански животни и растения.
Врагът
трябва да знае лично
CRISPR-Cas системите са уникален пример за адаптивния имунитет на бактериите. Когато ДНК фаг проникне в клетка, специални Cas протеини вграждат вирусни ДНК фрагменти с дължина 25-40 нуклеотиди в специфична област на бактериалния геном. Такива фрагменти се наричат spacers (от англ. Spacer - gap), областта, където се извършва вграждането, е касетата CRISPR (от английския. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) и процесът на придобиване на дистанционните се адаптира.
За да се използват спейсери в борбата срещу фаговата инфекция, трябва да се осъществи друг процес в клетката, контролирана от протеините Cas, наречена интерференция. Нейната същност е, че по време на транскрипцията на CRISPR касета се образува дълга РНК молекула, която се прекъсва от Cas протеини в кратки фрагменти - защитна (crRNA), всяка от които съдържа един спейсър. Cas протеините заедно с crRNA молекулата образуват ефекторния комплекс, който сканира цялата ДНК на клетката за наличието на последователности, идентични на спейсера (протопакерите). Намерените протоспакери се разцепват с Cas протеини.
Системите CRISPR-Cas се намират в повечето прокариоти, бактерии и археи. Въпреки че общият принцип на действие на всички известни CRISPR-Cas системи е един и същ, механизмите на тяхното функциониране могат да се различават значително в детайли. Най-големите разлики се проявяват в структурата и функционирането на ефекторния комплекс, поради което системите CRISPR-Cas са разделени на няколко типа. Към днешна дата са описани шест типа такива несвързани системи.
CRISPR-Cas системите са уникален пример за адаптивния имунитет на бактериите. Когато ДНК фаг проникне в клетка, специални Cas протеини вграждат вирусни ДНК фрагменти с дължина 25-40 нуклеотиди в специфична област на бактериалния геном. Такива фрагменти се наричат spacers (от англ. Spacer - gap), областта, където се извършва вграждането, е касетата CRISPR (от английския. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) и процесът на придобиване на дистанционните се адаптира.
За да се използват спейсери в борбата срещу фаговата инфекция, трябва да се осъществи друг процес в клетката, контролирана от протеините Cas, наречена интерференция. Нейната същност е, че по време на транскрипцията на CRISPR касета се образува дълга РНК молекула, която се прекъсва от Cas протеини в кратки фрагменти - защитна (crRNA), всяка от които съдържа един спейсър. Cas протеините заедно с crRNA молекулата образуват ефекторния комплекс, който сканира цялата ДНК на клетката за наличието на последователности, идентични на спейсера (протопакерите). Намерените протоспакери се разцепват с Cas протеини.
Системите CRISPR-Cas се намират в повечето прокариоти, бактерии и археи. Въпреки че общият принцип на действие на всички известни CRISPR-Cas системи е един и същ, механизмите на тяхното функциониране могат да се различават значително в детайли. Най-големите разлики се проявяват в структурата и функционирането на ефекторния комплекс, поради което системите CRISPR-Cas са разделени на няколко типа. Към днешна дата са описани шест типа такива несвързани системи.
Поради непрекъснатото
усъвършенстване на биоинформационните алгоритми за търсене, както и включването
на все по-голям брой прокариотни геноми в анализа, откриването на нови типове
системи CRISPR-Cas е въпрос на близко бъдеще. Също така е необходимо да се
открият подробните механизми на работа на много наскоро отворени системи. Така
статия, публикувана през 2016 г. в списание Science и посветена на анализа на
системата тип CRISPR-CasVI, описва протеина C2c2, който образува ефекторния комплекс
с crRNA, който има за цел да разгради не ДНК, а РНК. , В бъдеще това необичайно
свойство може да се използва в медицината за регулиране на активността на
гените чрез промяна на количеството на РНК, кодирана от тях.
Изследването на бактериофаговите стратегии на бактериофага, въпреки очевидната му основна природа и абстракция от задачите на практическата медицина, е донесло безценни ползи за човечеството. Примери за това са методите на молекулярно клониране и редактиране на геноми - насоченото вмъкване или премахване на мутациите и промените в нивото на транскрипция на определени гени.
Благодарение на бързото развитие на методите на молекулярната биология, само няколко години след откриването на механизма на действие на системите CRISPR-Cas, беше създадена работеща технология за геномно редактиране, която е в състояние да се бори с болести, които преди са били считани за нелечими. Наличието и простотата на тази технология позволяват да се разглежда като основа за бъдещето на медицината, ветеринарната медицина, селското стопанство и биотехнологиите, които ще се основават на насочени и сигурни генни модификации.
Няма съмнение, че по-нататъшното проучване на взаимодействието на бактерии и техните вируси може да ни отвори възможности, които сега дори не подозираме.
Изследването на бактериофаговите стратегии на бактериофага, въпреки очевидната му основна природа и абстракция от задачите на практическата медицина, е донесло безценни ползи за човечеството. Примери за това са методите на молекулярно клониране и редактиране на геноми - насоченото вмъкване или премахване на мутациите и промените в нивото на транскрипция на определени гени.
Благодарение на бързото развитие на методите на молекулярната биология, само няколко години след откриването на механизма на действие на системите CRISPR-Cas, беше създадена работеща технология за геномно редактиране, която е в състояние да се бори с болести, които преди са били считани за нелечими. Наличието и простотата на тази технология позволяват да се разглежда като основа за бъдещето на медицината, ветеринарната медицина, селското стопанство и биотехнологиите, които ще се основават на насочени и сигурни генни модификации.
Няма съмнение, че по-нататъшното проучване на взаимодействието на бактерии и техните вируси може да ни отвори възможности, които сега дори не подозираме.
Сензацията на
2018-та година
В Китай близнаците са родени с редактиран геном, който според идеята на експериментатора е защитен от ХИВ.
Етиката е един от основните препятствия пред въвеждането на нови научни открития и технологии в медицинската практика. Неотдавна се разгоря още една разгорещена дискусия след изявлението на китайския учен Й. Джанкуй от Южния университет по науката и технологиите, че той допринася за раждането на две бебета, чиито геноми са „редактирани“ на етапа на ембрионалните клетки. Документирано това твърдение не е подкрепено от нищо освен от интервюто, което смелият експериментатор е дал на Асошиейтед прес.
Технологията за редактиране на генома CRISPR / Cas е многократно тествана върху човешки ембриони от китайски и американски изследователи. Но всички тези работи бяха чисто експериментални: ембрионите бяха получени в резултат на изкуствено осеменяване, а след манипулации те бяха премахнати от експеримента на етап бластоцист, когато ембрионът е само малка група от клетки.
Сега китайският учен, каза той, довежда експеримента до своя логичен край - раждането на деца. Работил е със седем семейни двойки, които са ин витро оплодени. Във всяка двойка бъдещият баща беше заразен с ХИВ. И в клетки на ембриони, развиващи се in vitro, генът, кодиращ повърхностния лимфоцитен протеин CCR5, се редактира. Нова мутантна форма на този протеин дава на организма устойчивост на HIV инфекция. В същото време, според изследователя, целта не е била да се предотврати директното заразяване на деца от ХИВ от бащата (лекарите вече знаят как да го направят), а да им се даде основната способност да се противопоставят на тази инфекция в бъдеще.
В резултат на експеримента вече са се родили две момичета-близнаци с променен геном, а друга жена очаква само бъдещо потомство.
И тук възникват въпроси. Първо, хората с CCR5 мутация са наистина резистентни към ХИВ, но в същото време по-податливи на някои други инфекции, като вируса на Западен Нил и грип. Така че ползите от това редактиране далеч не са двусмислени.
Второ, тази процедура все още се счита за опасна поради недостатъчно точна „гледка“: в процеса на редактиране могат да бъдат причинени мутации в други, нецелеви гени, така че последствията могат да бъдат непредсказуеми. Освен това, за разлика от опитите за редактиране на генома на отделните клетки на възрастен организъм, редактирането на генома на ембриона включва прехвърляне на нови свойства чрез наследяване. Но ако промените са неблагоприятни, то ще се отрази негативно на бъдещите поколения.
Между другото, съдейки по интервюто, в този случай всичко е далеч от перфектно. Само едно момиче-близнак имаше копия на баща си и майката на копията на гена CCR5, докато другият имаше само една, а не всички тъкани. Това означава, че това дете всъщност няма защита срещу ХИВ, но може да е причинена вреда под формата на нецелеви мутации. Сега учените ще тестват генома на тези деца и ще открият в детайли какво се е случило накрая.
Ако погледнете от гледна точка на правната регулация, в Китай няма пряка забрана за редактиране на човешкия геном - има само забрана за клониране на хора. За разлика от Съединените щати, където манипулирането на генетичния материал на човешки ембриони, в допълнение към чисто научните цели, е напълно забранено. Но сега не само западните, но и китайските учени изразяват възмущение от безотговорния акт на He Jiankui и предлагат налагането на мораториум върху такива проучвания до приемането на правила за сигурност за тях.
Големият въпрос!
2018-та, 2019-та година са времето на
сериозни сензации, които преразглеждат от основи какво е човек, как регенерира,
произвежда енергия и се репликира.
Оказва се, че човек не е геномна структура, а микробиомна. Изследването на генома е глух коловоз за публичната наука, а за разгадаването на микробиома, човечеството не изглежда да е дозряло. Микробиомът в човека го запазва жив, защитава го от стареене и инфекции, синтезира антитела, витамини, ензими и хормони. Шокираща новина от последните научни анализи е, че в човешкия мозък има бактерии, в човешката кръв и въобще във всички тъкани, които до преди няколко години бяха смятани и „доказани“ за микробно стерилни.
Дори повърхностен инженерен анализ показва,
че и вирусите, и бактериите имат техногенен произход. Най-съвършените
електродвигатели се намират в бактериите. Немалко бактерии произвеждат
електричество. Не бактериите се
влияят от стрес и психика, а точно обратното, те са регулатори не само на
телесните функции, но и на менталните. Всяка психическа аномалия в една или
друга степен е свързана с дисбактериоза.
Бактериофагът
е вирус, „създаден“ с една цел – да унищожава бактериите в човека
Анализ на вирусите под електронен микроскоп
е шокиращ, това определено са вид нанороботи, участващи в битка срещу
бактериите, които запазват човек жив и определят всяка една част от
съществуването му.
С всяка изминала година, микробиологията и
нанороботиката се доближават до страшният въпрос: Кой
ни е създал и с каква цел? Към момента науката няма отговор на този
въпрос, за разлика от всички религии.
Не по-малко страшен е въпросът, дали Човекът
има право да променя проекта на Създателя си и до какви последици ще доведе
това?
Литература
Власов В. В. и др. Комплементарные здоровью. Прошлое, настоящее и будущее
антисмысловых технологий // НАУКА из первых рук. 2014. № 1 (55). С. 38—50. Кнорре Д. Г., Власов В. В. // Успехи химии. 1985. T. 54, № 9. С.1420—1447.
Медведев С. П. Как отредактировать наследственность // НАУКА из первых рук. 2014, № 1 (55). С. 10—14.
Сong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. 2013, V. 339.
P. 819—823.
Kim Y.G., Cha J., Chandrasegaran, S. (1996). Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 1156—1160.
Moghaddassi S., Eyestone W., Bishop C.E. (2014). TALEN-mediated modification of the bovine genome for large-scale production of human serum albumin. PLoS One 9, e89631.
Schwank, G., Koo, B.K., Sasselli, V. et al. (2013). Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell 13, 653—658.
Wu, Y., Liang, D., Wang, Y., Bai, M. et al. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell 13, 659—662.
Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Konermann S. et al. C 2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector // Science. 2016. V. 353: aaf5573.
Barrangou R., Fremaux C., Deveau H. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science. 2007. V. 315. P. 1709–1712.
Bikard D., Marraffini L. A. Innate and adaptive immunity in bacteria: mechanisms of programmed genetic variation to fight bacteriophages // Curr. Opin. Immunol. 2012. V. 1 P. 15–20.
Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S. et al. Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins // Nature. 2015. V. 526. P. 136–139.
Calendar R., Abedon S. T. The Bacteriophages // 2nd Ed., Oxford University Press. 2006.
Datsenko K. A., Pougach K., Tikhonov A. et al. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 945
Jiang W., Marraffini L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems // Annu. Rev. Microbiol. 2015. V. 69. P. 209–28.
Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. V. 337. P. 816–821.
Koonin E. V., Wolf Y. I. Is evolution Darwinian or/and Lamarckian? // Biol. Direct. 2009. V. 4. P. 42.
Lopez-Pascua L., Buckling A. Increasing productivity accelerates host-parasite coevolution // J. Evol. Biol. 2008. V. 3. P. 853–860.
Makarova K. S., Wolf Y. I., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems // Nat. Rev. Microbiol. 2015. V. 11. P. 722–736.
Moineau, S., Pandian S., Klaenhammer T. R. Restriction/modification systems and restriction endonucleases are more effective on lactococcal bacteriophages that have emerged recently in the dairy industry // Appl. Envir. Microbiol. 1993. V. 59. P. 197–202.
Neve H., Kemper U., et al. Monitoring and characterization of lactococcal bacteriophage in a dairy plant // Kiel. Milckwirtsch. Forschungsber. 1994. V. 46. P. 167–178.
Nuñez J. K., Harrington L. B., et al. Foreign DNA capture during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nature. 2015a. V. 527. P. 535–538.
Nuñez J. K., Kranzusch P. J., et al. Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nat. Struct. Mol. Biol. 2014. V. 21. P. 528–534.
Nuñez J. K., Lee A. S., Engelman A., Doudna J. A. Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nature. 2015b. V. 519. P. 193–198.
Paez-Espino D., Sharon I., et al. CRISPR Immunity Drives Rapid Phage Genome Evolution in Streptococcus thermophilus // MBio. 2015. V. 6: e00262–15.
Shmakov S., Abudayyeh O. O., Makarova K. S., et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. // Mol. Cell. 2015. V. 60. P. 385–397
Tan D., Svenningsen S. L., Middelboe M. Quorum sensing determines the choice of antiphage defense strategy in Vibrio anguillarum. // mBio 2015. V. 6: e00627–15.
Westra E. R., van Erp P. B., Künne T., et al. CRISPR immunity relies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiled invader DNA by Cascade and Cas3 // Mol. Cell. 2012. V. 46. P. 595–605.
Коментари
Публикуване на коментар
Привет, приятел. Всички коментари се одобряват от модератор. Не разходвай време, ако коментарът ти не облечен във факти и личен опит, липсва полезност за читателите.